Abstrakt
ÚVOD
Ulcerózna kolitída (UC) patrí k nešpecifickým zápalovým ochoreniam čreva. Príčina UC nie je známa ale z výskumov posledných rokov je zrejmé, že narušenie črevnej mikrobioty hrá významnú úlohu. Črevný mikrobióm je komplexný a dynamický ekosystém, ktorý dokáže ovplyvniť fungovanie hostiteľského makroorganizmu, jeho zdravie a choroby. Perspektívnou stratégiou v oblasti profylaxie a terapie niektorých ochorení sa ukazuje cesta modulácie dysbiotickej mikrobioty v prospech jej prirodzeného zloženia. Fekálna mikrobiálna transplantácia (FMT) je liečebná metóda, pri ktorej sa prenesie fekálna mikrobiota chorému jedincovi od zdravého darcu, čím sa obnoví normálne mikrobiálne zloženie čreva. V súčasnosti je pri FMT veľa nezodpovedaných otázok, preto je nevyhnutný ďalší výskum v tejto oblasti.
METODIKA
Cieľom postupu bolo overenie účinnosti transplantácie fekálnej mikrobioty (FMT) na animálnom pseudo germ-free (PGF) modeli s indukciou akútnej ulceróznej kolitídy (UC). Experiment bol vykonaný na 76 ks SPF myšiach samičieho pohlavia, línie BALB/c z chovu Velaz s.r.o. (Praha) ustajnené v gnotobiotických izolátoroch akreditovaného zariadenia Laboratória gnotobiológie, Katedry mikrobiológie a imunológie, UVLF, SR (SK U 16016). Celý experiment bol rozdelený do troch samostatných etáp podľa aplikačnej schémy (Tabuľka 1). V I. etape postupu bol myšiam s mikrobiologickým statusom SPF za účelom získania PGF modelu perorálne aplikovaný amoxicillin v dávke 387,11 mg/kg /myš/ a subkutánne aplikovaný ciprofloxacín v dávke 19,60 mg/kg/myš, každých 12 hod. po dobu 5 dní, pričom sme zvieratá odchovávali v presne definovanom prostredí gnotobiotických izolátorov. II. etapa zahŕňala chemickú indukciu akútnej ulceróznej kolitídy prostredníctvom per os aplikovaného 5% dextran sulfátu sodného (DSS). Vo finálnej III. etape sme aplikovali FMT v dávke 0,2 ml per os myšiam ako potenciálny terapeutický postup navodenej UC. Z dôvodu individuálneho príjmu DSS sme zvieratá na základe ich rozvíjajúceho sa individuálneho klinického obrazu UC, zahrňujúceho rektálne krvácanie a straty na celkovej hmotnosti, rozdelili do miernej (TZ-IBD/M), strednej (TZ-IBD/S) a ťažkej formy (aktivity) ochorenia (TZ-IBD/T). Kultivačné sledovanie mikrobiologických parametrov prebiehalo na dvoch kultivačných médiách TSA agar a Schaedler Agar. Identifikácia kultivovateľných baktérií prebehla na základe PCR reakcie a ich sekvencií génu 16S rRNA, identifikácia nekultivovateľných baktérií bola realizovaná amplikónovým sekvenovaním NGS.
Zdroj transplantátu
Komplexné mikrobiologické (bakteriálne a virologické) a parazitárne vyšetrenia darcov transplantátu sú presne stanovené na základe skríningu krvných patogénov amerického Červeného kríža. Pri výbere optimálneho zdravého darcu transplantátu boli zohľadnené anamnestické údaje zahrňujúce index telesnej hmotnosti (BMI=24), ktorý nesmel byť > 30, životný štýl darcu, vrátane výskytu prekonaných gastrointestinálnych porúch, syndrómu dráždivého čreva, celiakie, zápalového ochorenia čriev, kolitídy akéhokoľvek typu, infekcie Helicobacter pylori, nedávneho hnačkového ochorenia, užívanie antibiotík v predchádzajúcich 3 mesiacoch, imunosupresívnych liekov, cestovanie do rozvojových krajín za posledných 6 mesiacov, atď. V rámci komplexného mikrobiologického (bakteriálneho a virologického) a parazitárneho vyšetrenia darcu transplantátu bol realizovaný skríning krvných patogénov na Salmonella, Shigella, Clostridioides difficile (GDH a toxínov A, B), sérologické vyšetrenie na HIV, hepatitídu A, B, C a E, Treponema pallidum, Escherichia coli (enterotoxigénne, enteroinvazívne, enteropatogénne, enteroagregatívne a shiga podobné toxíny produkujúce kmene), druhy Vibrio cholerae, Campylobacter spp., parazitárne vyšetrenia na Strongyloides stercoralis, Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba histolytica, a virologické na cytomegalovirus (CMV) rotavirus, norovirus I a II, a adenovirus 40 a 41. Zo zápalových markerov bol v stolici imunologickým vyšetrením stanovený kalprotektín.
Tabuľka 1: Aplikačná schéma
VÝSLEDKY
V I. etape postupu dekontaminácia tráviaceho traktu myší selektívnymi antibiotikami mala za následok zníženie počtu kultivovateľných mikroorganizmov v obsahu céka na dva morfologicky odlišné typy kolónií. Pri analýze úseku DNA zodpovedajúcemu 16S rRNA prostredníctvom BLAST-n analýzy, sme zistili najväčšiu zhodu s druhom Escherichia coli RM9245 (GenBank: CP 044314.1) a s druhom Enterococcus gallinarum CIFRI-ONUSEG1 (GenBank: MN 481049.1), čo korešpondovalo s našimi predchádzajúcimi výsledkami (Gancarčíková a kol. 2020). Úspešná opakovateľnosť výsledku identifikácie bakteriálnych sekvencií bola potvrdená na úrovni druhu, avšak s odlišnými číslami databázy GenBank.
V III. fáze postupu sa u pseudo germ-free animálneho modelu (skupina TZ), ktorý bol charakterizovaný výraznou redukciou mikrobioty aplikoval humánny transplantát fekálnej mikrobioty. Amplikónovaným sekvenovaním (NGS) v cekálnej mikrobiote bol po aplikácii FMT zaznamenaný kvantitatívne hojnejší výskyt pôvodne zastúpených rodov z triedy Clostridia, s najvýraznejším vzostupom rodu Lachnospiraceae NK4A136 (z 0,3% na 9,48%), nezaradené Lachnospiraceae (z 1,01 na 29,57%), Lachnospiraceae UCG 006 (z 0,2% na 6,01%), a miernym zvýšením zástupcov Lachnoclostridium (z 0,3% na 0,71%) a rodu A2 (z 0,4% na 0,5). Zároveň bola potvrdená výrazná redukcia pôvodného dominantného rodu Roseburia z 95% na 11,25%, v prospech kvantitatívne menšej, ale rozmanitejšej, zmesi zástupcov FMT humánneho darcu, v ktorej boli zastúpení členovia rodov Oscillibacter, Blautia, Butyricicoccus, Anaerostipes, Colidextribacter, Marvynbriantia, Lachnospiraceae FCS020, Lachnospiraceae UCG 004, Incertae-Sedis, Flavonifactor. Z čeľade Bacteroidetes boli z FMT darcu prenesené rody Bacteroides, Odoribacter, Parabacteroides, Coprobacter a Barnesiella.
V cekálnej mikrobiote skupiny TZ-IBD boli po aplikácii FMT potvrdené výsledky poukazujúce na veľký posun mikrobioty v prospech kmeňa Firmicutes (92,32%) a potlačenia kmeňa Bacteroidetes (5,91%). Na základe alfa diverzity (pre Observed index) môžeme konštatovať, že po aplikácii FMT bola najvyššia diverzita v rámci taxonomického zatriedenia kmeňov (phylo-skupín) zaznamenaná u zvierat s indukciou ulceróznej kolitídy so strednou aktivitou ochorenia (TZ IBD/S). V cekálnej mikrobiote PGF myší s indukciou UC sme po aplikácii FMT podobne ako u skupiny zvierat TZ zaznamenali výraznú redukciu pôvodného dominantného rodu Roseburia z 95% na 11,71%, v prospech rodov pochádzajúcich ako z pôvodnej mikrobioty myší zastúpenej Lachnospiraceae NK4A136 (25,18%), nezaradené Lachnospiraceae (24,86%), Lachnospiraceae UCG 006 (4,33%), Lachnoclostridium (5,17%), ako aj rozmanitejšej zmesi zástupcov pochádzajúcich z FMT humánneho darcu, ako sú rody Barnesiella, Parabacteroides, Butyricicoccus a Blautia.
Alfa diverzita (Shannon a Simpson index, Obr.9) potvrdzuje, že po aplikácii FMT bola u zvierat s indukciou UC vyššia diverzita cekálnej mikrobioty, v porovnaní so skupinou TZ, čo poukazuje u myší bez indukcie UC na vyššie uplatnenie sa rezistentných zástupcov pôvodnej mikrobioty myší.
ZÁVER
Dysbióza PGF myší navodená selektívnou antibiotickou dekontamináciou bola po 5 dňovej transplantácii humánnej mikrobioty skupiny TZ upravená, teda FMT obnovila zdravú a rozmanitú črevnú mikrobiotu, nedošlo k premnoženiu potenciálne patogénnych mikroorganizmov a získali sme animálny model asociovaný s humánnou mikrobiotou. Transplantáciou humánnej fekálnej mikrobioty nebol u skupiny zvierat s indukciou UC (TZ IBD) potvrdený prenos patogénnych mikroorganizmov a nedošlo ani k pomnoženou zástupcov, participujúcich na rozvinutí ulceróznej kolitídy.
Táto publikácia bola vytvorená realizáciou projektov APVV-16-0176 a VEGA 1/0015/21.
Poster ke stažení
